Si è tenuto a Riccione il 23, 24 e 25 maggio 2013 il Congresso Nazionale di Medicina della Riproduzione, dove si è affrontato il tema della diagnosi pre-impianto e procreazione assistita, insieme ai massimi esperti del settore che si sono confrontati e hanno fatto il punto della situazione su tutte le novità e i vari aggiornamenti.

Al Congresso, il nostro centro GENERA ha vinto il premio per “la migliore comunicazione di un lavoro scientifico”, assegnato al Dott. Antonio Capalbo, embriologo e genetista del centro. In questo lavoro – nato dalla collaborazione tra il centro GENERA e il gruppo americano dell’RMANJ, dal titolo “Prima validazione indipendente in Europa della quantitative real-time (q)PCR per lo screening di aneuploidie cromosomiche in biopsie di trofoectoderma durante i cicli di Preimplantation genetic screening (PGS) allo stadio di blastocisti” – viene presentato per la prima volta in Europa la validazione di un metodo unico che permette un’analisi accurata, economica e veloce dei 24 cromosomi per l’analisi pre-impianto di anomalie cromosomiche.
Di seguito troverete un breve abstract di presentazione del lavoroAbstractIntroduzione: La prevalenza delle anomalie cromosomiche identificate mediante screening dei 24 cromosomi negli embrioni ottenuti in vitro sta contribuendo ad aumentare la richiesta di cicli di PGS nella popolazione di pazienti che si rivolgono ai centri di PMA per minimizzare il rischio di aborti ed aumentare l’outcome riproduttivo. L’analisi dei 24 cromosomi durante i cicli PGS può essere, ad oggi, eseguita con diverse tecnologie di biologia molecolare (array CGH, SNP array e quantitative real-time PCR) che si differenziano per risoluzione, tempo di analisi e costi. Nei programmi di PGS a blastocisti l’unica metodica che permette l’analisi rapida e compatibile con il trasferimento di blastocisti euploidi in ciclo fresco è la qPCR.
Obiettivi: Obiettivo dello studio è stato quello di validare per la prima volta in Europa e di introdurre nel nostro programma di PGS allo stadio di blastocisti la metodica di qPCR per lo screening dei 24 cromosomi. Come prima fase di validazione, 25 campioni di 5 cellule provenienti da linee cellulari di fibroblasti con cariotipo noto (GM00323: 46, XY e GM04435: 48,XY +16,+21) sono state analizzate mediante qPCR. Per valutare l’accuratezza della qPCR su campioni di trofoectoderma, 55 blastocisti diagnosticate come aneuploidi in seguito all’analisi tramite aCGH (tra Ottobre 2012 e Gennaio 2013) tramite metodo 24sure (Bluegnome) sono state ribioptizzate e rianalizzate in modo blinded mediante qPCR. Per minimizzare le variazioni biologiche dovute a mosaicismo cromosomico, i casi discordanti sono stati in seguito rianalizzati mediante una terza metodica di screening dei 24 cromosomi basata su SNP array. Quando lo SNP array, eseguito sempre in modo blinded, ha confermato il risultato di una delle 2 metodiche iniziali, alla restante è stato assegnato un falso diagnostico. La qPCR è stata condotta secondo un protocollo della durata di 4 ore e utilizzando 96 TaqMan copy number assays. L’analisi tramite SNP array è stata condotta utilizzando gli arrays GenomePlex e Affymetrix Nspl.
Risultati: Tutte le analisi dei campioni di 5 cellule proveniente da linea cellulare hanno dato risultato concordante con il cariotipo atteso (accuratezza 100%). La rianalisi dei campioni di trofoectoderma mediante qPCR ha evidenziato che nel 93% (51/55) degli embrioni sia stata confermata la medesima diagnosi originariamente ottenuta mediante aCGH, mentre 4 casi hanno mostrato una discordanza. La rianalisi tramite SNP array della terza biopsia di trofoectoderma di questi 4 embrioni ha rivelato che questi erano in realtà dei falsi positivi dell’aCGH per un singolo cromosoma. In tre di questi casi l’embrione è risultato euploide mentre l’aCGH aveva dato una diagnosi di aneuploidia per il singolo cromosoma (45,XY,-15; 45,XY,-8; 47,XX,+2). Inoltre, per 1 embrione è stata diagnosticata una monosomia del cromosoma 14 ed una trisomia del cromosoma 22 tramite l’aCGH, mentre qPCR e SNP array hanno confermato unicamente la monosomia 14. In totale, l’aCGH ha mostrato un tasso d’errore pari 7% (4/55) e la qPCR pari allo 0% (0/55) (Pearson Chi-square P=0.02) su campioni di trofoectoderma. Il tempo di analisi per ottenere risultati dalla biopsia alla diagnosi è stato confermato essere di 4 ore.
Conclusioni: In questo lavoro presentiamo la prima applicazione in Europa della qPCR per lo screening dei 24 cromosomi in biopsie di trofoectoderma per applicazione di PGS allo stadio di blastocisti. Questi risultati suggeriscono che lo screening delle aneuploidie dei 24 cromosomi può essere svolto tramite qPCR con elevatissima accuratezza e senza bisogno della crioconservazione, confermando l’esperienza maturata negli USA con tale metodica. Inoltre, il ridotto carico di lavoro per gli operatori e i bassi costi della qPCR permettono di contenere i prezzi aumentando le possibilità di accesso per i pazienti a tale metodica.